中欧体育app全站.刘昱东：生物制剂伴随诊断实验诊断技术临床应用进展

　　本文刊载于《临床实验室》杂志2022年12月刊“自身免疫性疾病实验诊断”专题-「实验室诊断技术导航」版块

　　单位：北京医院风湿免疫科、国家卫生健康委北京老年医学研究所（刘昱东），北京协和医学院在读硕士研究生（周传景），北京大学医学部在读硕士研究生（詹明华）

　　生物制剂是指利用基因工程、抗体工程或细胞工程等现代生物技术生产的蛋白质制剂，包括细胞因子、单克隆抗体（mAbs）和融合蛋白等，免疫原性也是生物制剂临床应用过程中最具有挑战性的问题之一。抗药物抗体（antidrug antibody , ADA）与生物制剂结合，影响药物的药代动力学和药效学，可能会降低功能性药物浓度，中和治疗作用继而导致治疗失败。 伴随诊断（Companion Diagnostics，CDx）是一种在用药之前对患者进行测试以确定患者对药物的反应（疗效、风险等），从而指导用药方案的实施的一种检测技术。本文将对生物制剂伴随诊断的实验室诊断技术方面的进展进行综述。

　　AID应用生物制剂伴随诊断项目主要涵盖药物浓度、ADA和抗免疫原性抗体三大内容，实验室检测技术主要有以下几个方面。

　　ELISA是一种经典的利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。通常使用捕获法来测定药物浓度， ADA则通常使用ELISA双抗原夹心法进行检测。

　　该方法的缺点在于检测血清或血浆样本时，通常会受到基质效应的影响，血液中的一些成分，如类风湿因子、抗异型抗体（以前免疫过的患者）和补体等，可能干扰读数造成假阳性。

　　TRFIA使用镧系元素及其螯合剂作为示踪物，常用Eu（铕）作为荧光标记，由于其荧光寿命为1ms，令其荧光值足以在激发光消失后检测到，在减少激发光影响的同时也可避免生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身发出荧光的影响。因此其相比传统的荧光分析（FIA）具有更高的灵敏度。

　　将生物制剂键合在生物传感器表面，再将样本注入并流经生物传感器表面。若发生抗原抗体结合则引起生物传感器表面质量的增加，导致折射指数按同样的比例增强，抗原抗体之间的反应即可通过观察折射指数而被捕捉到。

　　Feliciana Real-Fernández等通过不同的技术检测患者血清中的抗阿达木单抗抗体，其中便有SPR，SPR与其他方法在结果上有着良好的一致性。Marten Beeg等利用SRP测定了英夫利西单抗和抗英夫利西单抗抗体的血清浓度，此方法在灵敏度和重复性方面都有所保证，并且比商业化的ELISA试剂盒更具成本效益，避免了漫长的孵卵、分离、洗涤、检测步骤，降低了检测过程的复杂性和可变性。

　　HMSA是将配体结合试验与体积排阻色谱法 （SEC）结合的一种方法。SEC可以根据目标化合物的相对大小和形状进行分离。在HMSA方法中使用SEC可以区分不同大小的同型ADA。

　　Wang, S.-L.等利用该方法检测人血清中的抗英夫利昔抗体（ATI），并基于分子大小进行分离，结果表明该方法克服了传统ELISA方法中血清原有药物竞争性结合ADA致使敏感性下降这一缺点。

　　Barry D. Hock等开发了一种改良的、竞争性结合HMSA（cHMSA），用于在同类药物存在的情况下测定阿达木单抗。该方法克服了普通HMSA方法不能区分阿达木单抗和其他TNF特异性单克隆抗体的缺点，对阿达木单抗具有特异性，因此在近期接受过另一种抗TNF单克隆抗体治疗的患者中，cHMSA也能提供准确的抗阿达木单抗抗体定量信息。

　　细胞增殖会伴随着代谢酶活性的增加。当抗体药物偶联物（ADCs）药物与细胞作用后，细胞发生死亡或者凋亡，继而酶活性降低。中和抗体（neutralizing antibody，NAbs）是一类特殊的ADA，它与药物结合并阻断其治疗功能。在适当的ADCs药物浓度条件下，样本中若存在NAbs 则可以降低ADCs对细胞活性或增殖的抑制，以此判定NAb是否存在。

　　NAb能阻断药物到达其靶标或干扰与配体的结合，进而影响药物体内活性。利用NAb与药物靶蛋白竞争性结合药物的特性，若样本中含有NAb，则表现为药物与靶蛋白的结合在一定程度会被抑制。CLBA试验系统通常较基于细胞的试验系统有更高的灵敏度、精密度，良好的药物耐受，并可耐受较强的基质干扰。

　　英夫利昔单抗是首个被批准临床使用的抗TNF药物，用于控制包括类风湿关节炎（RA）、炎症性肠病（IBD）在内的慢性炎症性疾病，它与TNF-α结合，防止细胞因子激活细胞TNF受体复合物。英夫利昔单抗治疗期间，一些无效或不耐受的患者改用其他抗TNF药物也是有效的。

　　抗英夫利昔抗体的滴度与对TNF与药物结合的抑制性有关，在抗英夫利昔Ab阳性的血清中，较低的英夫利昔单抗谷水平（用药后稳态时最小血药浓度）更为常见，且使用英夫利昔单抗诱导产生抗体的患者血清未显示出与其他两种已批准的抗TNF制剂（依那西普和阿达木单抗）发生结合反应的能力。还有一项系统性回顾研究发现，对于抗TNF治疗疗效不佳的IBD患者，低药物谷水平并且能检测到ADA的患者改用另一种抗TNF药物比增加药物剂量更加有效，低药物谷水平但未检测到ADA的患者增加用药剂量后疗效会比更换抗TNF药物更加显著，而高药物谷水平的患者无论是增加药物剂量还是更换抗TNF药物，其收益都并不显著。因此，测定药物血清谷水平和ADA滴度对IBD患者的治疗药物监测有重要的临床应用价值。

　　IFNβ是（多发性硬化症）MS的一线治疗方法，能够降低疾病的复发率与致残率。已有不少研究表明，抗IFNβ抗体会降低IFNβ的生物活性，并使药物疗效下降。通过对NAb的检测，可以实现对IFN-β治疗疗效的预测，对指导临床用药有重要的应用价值。

　　纳他利珠单抗（natalizumab）是一种抗α4-整合素的单克隆抗体，被批准用于治疗多发性硬化症，该抗体与淋巴细胞表面的整合素α4β1（迟现抗原-4, VLA-4）合，阻断其与内皮中存在的受体VCAM-1（血管细胞粘附分子1）的结合，从而干扰淋巴细胞向中枢神经系统的运输，进而延缓MS的疾病发展。纳他利珠单抗抗体的存在会致使药物血清浓度的降低和治疗效果的丧失。患者用药早期抗体检测结果（在治疗的六个月内）可能会导致错误的临床指导，对患者体内ADA的长期连续性监测能更好的了解患者ADA的生成情况，以调整治疗方案，降低风险，优化患者的治疗。

　　利妥昔单抗是一种单克隆嵌合IgG1抗体，靶向B细胞特异性细胞表面抗原CD20。它的B细胞清除作用在各种自身免疫性疾病中都有应用。在15例原发性干燥综合征患者中，利妥昔单抗特异性抗体与血清疾病风险增加相关，在6例SLE患者和2例ANCA相关血管炎患者中，利妥昔单抗特异性抗体与复发风险增加相关。也有研究发现利妥昔单抗治疗会导致高滴度的抗药抗体，并影响B细胞清除效果。近期，Kidoguchi K等还通过测定利妥昔单抗抗体来预测SLE患者的输液反应，对于有发生输液反应风险的患者则考虑更换B细胞清除剂（如奥法木单抗）。可见在许多疾病的治疗中，通过对ARA的检测能够实现相关不良事件的预测，更好地指导临床治疗。

　　经聚乙二醇PEG修饰后的蛋白表面能产生水化相，以减少它们与单核吞噬细胞的相互作用，以此增加它们在血液中的停留时间，延长半衰期。越来越多的文献报道PEG本身具有高度免疫原性。抗PEG抗体通过聚乙二醇化脂基纳米颗粒触发补体激活，这可能会破坏药物的完整性，导致药物过早释放或暴露于血清蛋白。Nicoletta Bivi等开发并验证了亲和捕获洗脱（ACE）-AGL检测方法，作为一种新方法，可以同时检测针对药物及其PEG部分的抗体，具有高灵敏度、耐药性和准确性。

　　有不少研究发现，抗聚乙二醇抗体会影响聚乙二醇化药物的血药含量。普瑞凯希（Pegloticase），作为一种聚乙二醇化尿酸特异性酶，近日由FDA批准与甲氨蝶呤联用来治疗难治性痛风。Peter E Lipsky等在169例接受普瑞凯希治疗的患者中，69例（41%）出现高滴度抗普瑞凯希 Ab（1:2430）， 40%（67/169）的患者出现抗PEG抗体;仅14%（24/169）的患者出现抗尿酸酶抗体，且多为低滴度，其中抗PEG抗体的发生率和滴度与血清普瑞凯希的含量降低相关。可见，临床上可以通过对抗聚乙二醇抗体的监测来确定适当的给药策略或决定是否更换为非聚乙二醇化药物。

　　2.6基于AAV的基因治疗药物因为野生型AAV感染非常常见， 30-60%的未用药个体体内都存在阻止AAV转导的中和抗体存在（NAbs）, 且经常对不同的AAV血清型产生交叉反应。体内已有的抗AAV抗体会严重影响AAV基因治疗的疗效，即使低NAb滴度也会影响转基因的表达。因此在治疗前进行抗AAV抗体的检测。最近Janina Haar等建立了一种基于中尺度发现（MSD）的分析方法，用于定量分析AAV2, AAV8和AAV9三种最常用AAV血清型的结合抗体（BAbs）和NAbs，相较传统的ELISA 、细胞为基础的NAbs检测等，有快速、可扩展，只需要少量的血清样本、消耗品和病毒储备等优点。 为确保治疗的有效性，许多基因治疗药物的临床试验都纳入了血清抗AAV抗体阳性患者的排除标准。

　　随着各类生物制剂在生物医药领域的广泛应用，药物的免疫原性仍然是长期用药的主要限制因素。但因缺乏统一的检测标准，许多生物制剂的相关伴随诊断往往难以实施。通过对抗药抗体/抗免疫原性抗体相关检测技术及其临床意义的不断研究将推进伴随诊断的综合发展，不断挖掘其临床应用潜力，以此进一步促进个体化用药，指导制定合理治疗方法。

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