中欧体育app全站.利用Incucyte活细胞分析系统加速研究溶血病理

　　几十年来，科学家们一直致力于研究溶血对器官的损伤作用，但仍未完全发现驱动这种病理现象的内在机制。

　　近期，美国圣裘德儿童医院的研究人员在《Cell》期刊上发表了一篇名为“NLRP12-PANoptosome activates PANoptosis and pathology in response to heme and PAMPs”的研究文章。该研究力求一种先天免疫模式来识别受体NLRP12，揭示其作为引发炎性细胞死亡和病理反应的关键分子。此项发现为理解先天免疫反应中的细胞死亡和病理机制提供了重要视角。

　　值得注意的是，赛多利斯的Incucyte实时活细胞分析系统的应用起到了关键作用，承担了整个实验大约80%的工作量，成为了构建研究的主要核心工具。该活细胞分析系统显著地推动了研究的进展，那么，文章是如何应用Incucyte实时活细胞分析系统进行实验观察和数据收集的呢？

　　先天免疫是由病原体、病原相关分子模式（PAMP）或损伤相关分子模式（DAMP）激活引起的，增强的免疫激活可导致细胞损伤、组织破坏和器官损伤，以及DAMP的释放（图1）。模式识别受体（PPR）因其可以感知非特异性PAMP或DAMP的能力而被经典研究，然而，多种PAMP和DAMP对PRR的联合激活尚未得到很好的表征。

　　在研究的初期阶段，研究人员首先需要建立一个体外模型来模拟感染，推动先天免疫反应和炎症细胞的死亡。如图2所示，利用多种DAMP、PAMP及其组合分子来诱导细胞死亡，选用骨髓源性巨噬细胞（BMDM）作为实验模型，并采用Incucyte进行检测（图2）。研究结果显示，单独的PAMP如Pam3、poly(I:C)、LPS或R848对BMDM处理时，触发的死亡比例较低。然而，PAMP的组合在多种情况下能诱导大量的细胞死亡（图2）。单个DAMP或其组合对BMDM的细胞死亡影响不大。但是，PAMP与DAMP的组合，特别是血红素与Pam3、LPS或R848的组合，显示出强烈的细胞死亡反应。这些发现强调了特定PAMP组合以及血红素与PAMP组合在诱导细胞死亡方面的潜力。

　　遵循图1的研究路线，接下来的任务是通过干扰中间受体和信号分子，来探究是否能改变细胞死亡的表型。在这一步骤中，Incucyte的高通量自动成像和分析功能将全面支持本文的研究，全程自动记录并分析细胞死亡的比例。

　　Incucyte实时活细胞分析系统不仅可检测常规细胞死亡，使用特殊活细胞检测试剂，还可检测线粒体ROS产生。血红素暴露通过产生活性氧(ROS)触发巨噬细胞中的细胞死亡。血红素加PAMP刺激导致BMDM中线粒体ROS(mitoROS)的产生（图3AB）。使用ROS清除剂N-乙酰L-半胱氨酸(NAC)进行处理可显著防止细胞死亡（图3C），表明ROS产生与诱导细胞死亡之间存在机制联系。

　　在这篇文章中，无论是探索病原相关分子模式（PAMP）、损伤相关分子模式（DAMP）及其组合对细胞死亡的影响，还是后续通过干预中间信号分子来观察细胞死亡情况，都需要对浓度和时间点进行精确控制。在这些实验中，Incucyte的实时监测功能显得尤为重要。该系统能够实时检测并确定细胞死亡的最高时间点和最适浓度，显著降低实验的工作量并提高科研效率。

　　每次推荐Incucyte活细胞分析系统时，常常会被问及：这台设备有何独特之处，能实现其他设备无法完成的任务吗？这篇文章可能就是答案了。

　　科研工作常常是在最后的20%时间获取80%的结果，大部分时间都处于探索和摸索阶段。而Incucyte的优势便是能大幅度缩短这一探索阶段的时间。

　　这项新研究确定了NLRP12作为诱导炎症性细胞死亡和质膜破裂致病的关键因子，并指出其作为药物靶标的潜力，能有效减少器官损伤。下面的文章进一步的研究探讨了如何利用这一基础机制设计抗体药物，目的是抑制程序性细胞死亡中的质膜破裂，从而减弱炎症反应和病理损伤。这种方法展示了通过靶向特定分子路径来缓解炎症性疾病的可能性。

　　关于细胞质膜破裂（PMR）有一个有趣的观点转变。过去的观点认为，PMR是一个由渗透压变化引起的被动过程，细胞是“胀”破的；然而，这个观点在21年被推翻了。进一步研究表明：质膜破裂及LDH和DAMP的释放需要一种名为NINJ1的蛋白参与，如果该蛋白发生突变，PMR就不会发生。因此，我们是否能够通过抑制NINJ1来限制过度细胞死亡的质膜破裂呢？

　　为了生产NINJ1阻断抗体，使用全长NINJ1对NinJ1−/−小鼠免疫接种，分离15000个IgM阴性-B细胞，对筛选到的217种重组抗小鼠NINJ1 IgG2a单克隆抗体进行功能筛选，确定clone D1（Ninj1-575）是NINJ1依赖性PMR的（图4A）。同时，clone D1抑制了HEK293T细胞中小鼠NINJ1（而非人NINJ1）异位表达引起的膜损伤（图4B）

　　之后，研究人员又使用FITC标记的150kDa dextran导入BMDM细胞作为工具，当质膜破裂，荧光信号消失。与同种型对照抗体相比，克隆D1以剂量依赖性方式降低BMDM中的PMR，克隆25表现出质膜破裂阻断活性，但不如克隆D1有效（图5）。

　　本研究提供了从基础研究到临床药物研发的高效研究策略框架。在识别出疾病的关键病因后，寻找阻断这些因素的策略成为优先任务。对细胞表面分子而言，使用单一抗原的抗体来抑制其功能是一种直接的策略。在此过程中，iQue®高通量流式细胞仪可以在仅仅5分钟内完成96孔板的B细胞筛选。在抗体生产阶段，关注细胞的亲和力和浓度至关重要，Octet®非标记分子互作系统能提供这方面的精确数据。最后，在验证抗体效果时，我们利用了Incucyte活细胞分析系统，该系统能实时监控细胞增殖和死亡等关键指标，以评估抗体的功效。

　　①长时程，不闲置：培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔自动拍摄，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害

　　③智能化拍摄，AI分析：高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数；

　　④完整解决方案：大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol；文章数大于14,000篇，是长时间活细胞成像产品中的佼佼者

　　⑤多种应用的配套拍摄模式：针对3D类器官/肿瘤球、线粒体膜电位、神经突、血管生成等应用都有配套的拍摄及分析模式

产品说明书